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做過(guò)病理實(shí)驗(yàn)的人都知道，實(shí)驗(yàn)看似容易，但真想把它做好，還是需要花上很長(zhǎng)一段時(shí)間去積累和摸索經(jīng)驗(yàn)。我從事病理實(shí)驗(yàn)已有 6 年多了，在這段時(shí)間里，我做過(guò)許許多多病理相關(guān)實(shí)驗(yàn)，剛開(kāi)始啥也不懂，一味按照網(wǎng)上操作流程來(lái)做，但做的結(jié)果往往并不是十分理想，最終結(jié)果未能達(dá)到預(yù)期的效果。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的瀏覽和學(xué)習(xí)，在論壇內(nèi)學(xué)習(xí)、請(qǐng)教，并結(jié)合實(shí)踐操作，我經(jīng)歷了初級(jí)——查找資料和摸索方法；中級(jí)——問(wèn)題求助和不斷總結(jié)；高級(jí)——難題解答和經(jīng)驗(yàn)分享這三個(gè)階段，也學(xué)到了不少知識(shí)，積累了很多寶貴經(jīng)驗(yàn)，與大家一起分享。
一、石蠟切片和冰凍切片的比較？
1.要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是我向一老師請(qǐng)教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。
2.冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒(méi)石蠟的漂亮。當(dāng)你買(mǎi)一抗時(shí)，目錄上都寫(xiě)著做什么樣的切片，如果它寫(xiě)著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫(xiě)著兩者都可，那就都能做。
3.石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)是可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在 -80oC 的低溫冰箱中，尤其是用來(lái)做原位雜交的切片，為了防止 RNA 降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到 4 μm 左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。
二、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？
1.單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱(chēng)為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過(guò)封閉等避免）。
2.應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于 WB ( Western blotting）或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。
3.種屬反應(yīng)性的選擇。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。
4.種屬來(lái)源，一般兔來(lái)源的多是多克??；而小鼠來(lái)源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來(lái)源來(lái)選擇相應(yīng)的二抗。
5.生產(chǎn)廠家的選擇。如 santa Cruz 公司抗體一般 1 ml，價(jià)格 2100 元左右；而 chemicon 公司一抗一般 100 μl，價(jià)格 2800 元左右。這兩個(gè)廠家的同一種抗體，它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做 WB 效果還可以。
三、在什么情況下使用 Triton-X100？
1.Triton X-100 化學(xué)名稱(chēng)為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(10 μm 以上厚切片) 和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用 Triton X-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。
2.其作用原理：Triton X-100 可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
3.Triton X-100 既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。
四、封閉血清的選擇原則是什么？
1.膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性。
2.封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。
3.也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。
五、抗體孵育條件的比較？
1.一抗孵育溫度有幾種：4oC、室溫、37oC，其中 4oC 效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37oC 1-2 h，而 4oC 過(guò)夜和從冰箱拿出后 37oC 復(fù)溫 45 min。
2.二抗一般室溫或 37oC 30 min - 1 h，具體時(shí)間需要摸索。
六、一抗 4℃ 孵育后為什么要進(jìn)行 37℃復(fù)溫？
1.一方面，防止切片從 4oC 直接放入 PBS 易脫片。
2.另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用，4oC 和 37oC 時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
3.其實(shí)，我更贊同后一種說(shuō)法，因?yàn)槲覈L試把肝臟或睪丸片子從 4 ℃過(guò)夜拿出后，直接用 PBS 洗沒(méi)發(fā)生過(guò)脫片現(xiàn)象。事實(shí)勝于雄辯。
七、DAB 顯色時(shí)間如何把握？
1.DAB 顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗。
2.DAB 顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時(shí)間。
3.若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能是你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間。
4.DAB 顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗 4oC 過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
八、免疫組化結(jié)果如何分析？
1.陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在 40 * 光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的 10 個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組 3-6 張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。
2.灰密度分析法。通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j 進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。
3.評(píng)分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（0-3 分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（1-4 分為 0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。
對(duì)于以上這幾種方法，各有利弊，請(qǐng)細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。
九、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？
1.由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。
2.修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高 pH 的等）。
3.微波修復(fù)，我們一般用 6 min * 4 次，效果不錯(cuò)。
十、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？
1.一般 3% 過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以 10 min 左右；而 0.3% 過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般 10-30 min。
2.用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或 PBS 好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片。
3.現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4oC 避光保存。
十一、如何才能充分脫蠟？
1.蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問(wèn)題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；
2.脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5 min 就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng)，10-20 min 或更長(zhǎng)。
3.當(dāng)天切的切片，燒烤 2 小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過(guò)程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫 10-20 min，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果會(huì)更好。
總之，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來(lái)決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。
十二、如何最大限度地降低組織非特異性染色？
1.縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條；
2.一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議用單克隆抗體看看；
3.內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；
4.非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；
5.縮短 DAB 孵育時(shí)間或降低 DAB 濃度/過(guò)氧化氫濃度等；
6.適當(dāng)增加 PBS 沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤為重要；
7.防止標(biāo)本染色過(guò)程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。
十三、蘇木素復(fù)染時(shí)間的把握？
1.蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過(guò)這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。
2.鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（動(dòng)作一定要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。
3.如果分化的顏色過(guò)淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。
十四、PBS 的清洗方式選擇、次數(shù)和時(shí)間的選擇？
1.單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染?！?
臨床上每天檢測(cè)的病例很多，所用的抗體種類(lèi)及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們?cè)谝粋€(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的 PBS 為一次性，保證切片沒(méi)有相互交叉污染的機(jī)會(huì)。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將 PBS 從上輕輕地沖洗，讓 PBS 自上而下流下來(lái)，不要拿起切片將 PBS 對(duì)準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的 PBS 有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切片的脫落。
3.沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費(fèi)時(shí)間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無(wú)需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入 PBS，持續(xù) 2 min 左右就完全足夠了。
4.PBS 的 pH 和離子強(qiáng)度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（pH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。我們目前常用的 PBS 的 pH 在 7.4-7.6 ，濃度是 0.01 M，根據(jù)本室十幾年來(lái)的使用情況，認(rèn)為該溶液價(jià)格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學(xué)的染色過(guò)程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB 的配制都離不開(kāi)緩沖液?？梢?jiàn)緩沖液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過(guò)酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。
十五、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？
1.多聚賴(lài)氨酸玻片質(zhì)量的問(wèn)題。我原先是買(mǎi)的，后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)。
2.組織切的不好，切片機(jī)的問(wèn)題例如比較老的舊的機(jī)器切得厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
3.組織的問(wèn)題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類(lèi)越容易脫。
4.沒(méi)烤好，時(shí)間短溫度不夠之類(lèi)。
5.操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。
6.修復(fù)的問(wèn)題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)了，或者放進(jìn) 100oC 的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用 EDTA 修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到 EDTA 的時(shí)候也沒(méi)辦法，只有從另外的問(wèn)題上著手。
7.此外，一旦見(jiàn)到有組織漂起來(lái)操作就更加要謹(jǐn)慎，用 PBS 的時(shí)候盡量用泡的，不要沖?；旧习堰@些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。
十六、背景染色較深的原因有哪些？
1.抗體濃度過(guò)高：一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。
2.抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的 1 h，而是 30 min，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
3.DAB 變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB 最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的 DAB 不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與 DAB 產(chǎn)生反應(yīng)而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB 的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
4.組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周?chē)?huà)圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
5.切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于 24 h）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在 4oC 冰箱過(guò)夜，對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。
6.一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過(guò)期的抗體要么不顯色要么背景著色。用新買(mǎi)的抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。