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real-time PCR 常用儀器和探針
1.SYBR Green I：
一種DNA結(jié)合染料，能非特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合后發(fā)出熒光，價(jià)格便宜，但因無(wú)特異性，易受到非特異性擴(kuò)增和引物二聚體地的影響，是定量結(jié)果不可靠?？捎萌诮馇€分析區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增，引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)消除非特異性熒光有很大幫助。
2.Taqman探針：
也稱(chēng)為水解寡核苷酸探針。該探針在5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)，在3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)，在探針完整時(shí)報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅熒光基團(tuán)吸收，因此沒(méi)有熒光產(chǎn)生。在延伸階段，由于DNA聚合酶具有5’－3’外切酶活性，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)被水解掉，遠(yuǎn)離淬滅熒光基團(tuán)，于是產(chǎn)生熒光信號(hào)。Taqman探針的優(yōu)點(diǎn)是可以利用多種熒光同時(shí)進(jìn)行多重分析，這是SYBR等DNA結(jié)合熒光基團(tuán)所不具備的優(yōu)點(diǎn)。
3.分子信標(biāo)（molecular beacons）：
為一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，環(huán)區(qū)與目的片段特異性互補(bǔ)，莖區(qū)的5’端和3’端分別標(biāo)有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。自由狀態(tài)的分子信標(biāo)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊密接觸，能量以熱的形式消除，不產(chǎn)生熒光。退火時(shí)，發(fā)夾結(jié)果打開(kāi)，環(huán)區(qū)與目的片段特異性互補(bǔ)結(jié)合，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)，釋放出熒光。分子信標(biāo)優(yōu)于Taqman探針之處是可以檢測(cè)單個(gè)核苷酸的突變，適合于SNP分析和等位基因突變分析。缺點(diǎn)是設(shè)計(jì)比較困難，既要避免產(chǎn)生強(qiáng)的背景信號(hào)，又要避免莖部雜交過(guò)強(qiáng)，影響其與模板的退火，從而影響熒光的生成。
4.雜交探針：
是一種新型的熒光探針，由兩條探針組成，一條在5’端標(biāo)記熒光（3’端被封閉，以防止退火后的延伸），一條在3’端標(biāo)記熒光，其中一個(gè)為受體熒光基團(tuán)，另一個(gè)為供體熒光基團(tuán)，供體熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜覆蓋受體熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜，自由狀態(tài)時(shí)只能檢測(cè)到供體熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。退火時(shí)兩條探針與目的基因特異性結(jié)合，形成首尾連接，兩個(gè)熒光基團(tuán)互相靠近，供體基團(tuán)發(fā)出的能量激發(fā)受體基團(tuán)發(fā)出熒光，檢測(cè)時(shí)只檢測(cè)受體基團(tuán)發(fā)出的熒光。只有當(dāng)兩條探針均與目的基因特異性結(jié)合時(shí)，才能檢測(cè)到受體基團(tuán)發(fā)出的熒光，因此檢測(cè)的特異性大大增加。
5.Scorpion引物/探針：
由一條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針和一條引物構(gòu)成，探針的5’端和3’端分別標(biāo)有報(bào)告熒光和淬滅熒光，3’端通過(guò)一個(gè)非擴(kuò)增的單體（防止探針退火后的延伸）與引物的5’端相連。在自由狀態(tài)，報(bào)告熒光和淬滅熒光很接近，不產(chǎn)生熒光。變性階段莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，退火時(shí)引物與模板結(jié)合并延伸，環(huán)區(qū)與新合成的目的基因的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，此時(shí)Scorpion探針與PCR產(chǎn)物在同一條DNA鏈上，是分子內(nèi)的結(jié)合。由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，報(bào)告熒光和淬滅熒光分離，因此可檢測(cè)到報(bào)告熒光發(fā)出的熒光信號(hào)。由于Scorpion引物/探針中序列特異性引物和探針在同一分子上，因此信號(hào)的產(chǎn)生特別快。
一種DNA結(jié)合染料，能非特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合后發(fā)出熒光，價(jià)格便宜，但因無(wú)特異性，易受到非特異性擴(kuò)增和引物二聚體地的影響，是定量結(jié)果不可靠?？捎萌诮馇€分析區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增，引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)消除非特異性熒光有很大幫助。
2.Taqman探針：
也稱(chēng)為水解寡核苷酸探針。該探針在5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)，在3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)，在探針完整時(shí)報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅熒光基團(tuán)吸收，因此沒(méi)有熒光產(chǎn)生。在延伸階段，由于DNA聚合酶具有5’－3’外切酶活性，5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)被水解掉，遠(yuǎn)離淬滅熒光基團(tuán)，于是產(chǎn)生熒光信號(hào)。Taqman探針的優(yōu)點(diǎn)是可以利用多種熒光同時(shí)進(jìn)行多重分析，這是SYBR等DNA結(jié)合熒光基團(tuán)所不具備的優(yōu)點(diǎn)。
3.分子信標(biāo)（molecular beacons）：
為一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，環(huán)區(qū)與目的片段特異性互補(bǔ)，莖區(qū)的5’端和3’端分別標(biāo)有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。自由狀態(tài)的分子信標(biāo)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊密接觸，能量以熱的形式消除，不產(chǎn)生熒光。退火時(shí)，發(fā)夾結(jié)果打開(kāi)，環(huán)區(qū)與目的片段特異性互補(bǔ)結(jié)合，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)，釋放出熒光。分子信標(biāo)優(yōu)于Taqman探針之處是可以檢測(cè)單個(gè)核苷酸的突變，適合于SNP分析和等位基因突變分析。缺點(diǎn)是設(shè)計(jì)比較困難，既要避免產(chǎn)生強(qiáng)的背景信號(hào)，又要避免莖部雜交過(guò)強(qiáng)，影響其與模板的退火，從而影響熒光的生成。
4.雜交探針：
是一種新型的熒光探針，由兩條探針組成，一條在5’端標(biāo)記熒光（3’端被封閉，以防止退火后的延伸），一條在3’端標(biāo)記熒光，其中一個(gè)為受體熒光基團(tuán)，另一個(gè)為供體熒光基團(tuán)，供體熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜覆蓋受體熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜，自由狀態(tài)時(shí)只能檢測(cè)到供體熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。退火時(shí)兩條探針與目的基因特異性結(jié)合，形成首尾連接，兩個(gè)熒光基團(tuán)互相靠近，供體基團(tuán)發(fā)出的能量激發(fā)受體基團(tuán)發(fā)出熒光，檢測(cè)時(shí)只檢測(cè)受體基團(tuán)發(fā)出的熒光。只有當(dāng)兩條探針均與目的基因特異性結(jié)合時(shí)，才能檢測(cè)到受體基團(tuán)發(fā)出的熒光，因此檢測(cè)的特異性大大增加。
5.Scorpion引物/探針：
由一條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針和一條引物構(gòu)成，探針的5’端和3’端分別標(biāo)有報(bào)告熒光和淬滅熒光，3’端通過(guò)一個(gè)非擴(kuò)增的單體（防止探針退火后的延伸）與引物的5’端相連。在自由狀態(tài)，報(bào)告熒光和淬滅熒光很接近，不產(chǎn)生熒光。變性階段莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，退火時(shí)引物與模板結(jié)合并延伸，環(huán)區(qū)與新合成的目的基因的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，此時(shí)Scorpion探針與PCR產(chǎn)物在同一條DNA鏈上，是分子內(nèi)的結(jié)合。由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，報(bào)告熒光和淬滅熒光分離，因此可檢測(cè)到報(bào)告熒光發(fā)出的熒光信號(hào)。由于Scorpion引物/探針中序列特異性引物和探針在同一分子上，因此信號(hào)的產(chǎn)生特別快。