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產(chǎn)品展示
產(chǎn)品說明:
本試劑盒是高靈敏度、高特異性擴(kuò)增cDNA 3′末端全長的試劑盒。對RNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí)，一般先通過RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的區(qū)域，然后再對擴(kuò)增出的目的DNA片段進(jìn)行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR反應(yīng)很難得到全長的cDNA片段，而RACE法能有效地解決這一問題。Bioteke公司生產(chǎn)的3’RACE試劑盒能夠通過已知的cDNA序列，高靈敏度、高特異性地?cái)U(kuò)增cDNA的3′末端的全長序列。本試劑盒中含有完成3′-RACE操作的主要試劑。試劑盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）經(jīng)過了本公司的特殊改良，反轉(zhuǎn)錄性能良好，無RNase H活性，大大增加了反轉(zhuǎn)錄性能。進(jìn)行3′RACE 實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先由Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再使用Bioteke LA Taq，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)。3′RACE Adaptor作為反轉(zhuǎn)錄引物用于合成1st Strand cDNA；使用基因上游外側(cè)特異性引物1和3′RACE Primer 1進(jìn)行1st PCR反應(yīng)。如果1st PCR反應(yīng)未能得到目的產(chǎn)物，再使用基因上游內(nèi)側(cè)特異性引物2和3′RACE Primer 2進(jìn)行2nd PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行DNA測序或TA克隆。
產(chǎn)品組成：
制品可用于20次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（約100次3′RACE PCR反應(yīng)）
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組分名稱
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20次
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Reverse Transcriptase M-MLV
（Rnase H-）（200U、μl）
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20μl
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Rnase inhibitor （40U、μl）
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20μl
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5×M-MLv Buffer
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80μl
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dntp Mixture （10mM each）
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20μl
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3’RACE Adaptor （10μM）
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20μl
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Rnase Free d h2o：
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1ml
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3’RACE Primer 1（10μM）
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200μl
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3’RACE Primer 2（10μM）
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200μl
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實(shí)驗(yàn)時(shí)需要自備的其他試劑：擴(kuò)增目的DNA片段的上游特異性引物；PCR用DNA聚合酶。我們推薦使用Bioteke LA Taq，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用其他PCR用DNA聚合酶。
試劑盒注意事項(xiàng):
◆ 同時(shí)需要進(jìn)行數(shù)次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先配制各種試劑的混合液（Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture等），然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。這樣，可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確，減少試劑損失，避免重復(fù)分取同一試劑。同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)操作或?qū)嶒?yàn)之間產(chǎn)生的誤差。
◆ 使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、RNase Inhibitor等酶類時(shí)，應(yīng)輕輕混勻，避免起泡，分取之前要小心地離心收集到反應(yīng)管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時(shí)應(yīng)慢慢吸取。從-20℃中取出，使用后也應(yīng)立即放回-20℃中保存。
問題解答
1. RT-PCR反應(yīng)后，無PCR產(chǎn)物或出現(xiàn)Smear，怎么辦？
此時(shí)請從提取的RNA樣品的純度和添加量、基因的表達(dá)豐度、基因的長度和GC含量、引物的設(shè)計(jì)情況、參考文獻(xiàn)的可信度以及RT-PCR條件的設(shè)定等方面加以考慮。
2. PCR反應(yīng)時(shí)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的使用量使用多少較為合適？
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的使用量可控制在1μl～10μl的范圍。
3. 3′RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后，有時(shí)為什么出現(xiàn)多條帶現(xiàn)象？
可能是因?yàn)槲粗蛄行畔⒉磺宄?dǎo)致了非特異性擴(kuò)增； 擴(kuò)增的基因?yàn)槎嗷蚣易宓某蓡T；mRNA不同的拼接方式造成的。
上一個(gè)：Thermo OneStep RT-PC
下一個(gè)：5’RACE kit